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Interdev Agroalimentaire  

PREPARATION DES EXTRAITS DE PEPSINE À PARTIR DES CAILLETTES DES ZÉBUS ADULTES (Bos indicus)

	Type de fiche	Techniques/Technologies
	Date(s) de l’expérience	2004/01/01 - 2004/01/01
	
	Zone géographique	Afrique centrale; Cameroun; Province de l'Admamaoua Cameroun
	Mots clés	LAIT CAILLE; LAIT

	Echelle d’action	National
	Public(s) cible(s)	Chercheurs, Transformateurs artisanaux petite entreprise

Résumé
L'industrie laitière est en plein essor au Cameroun et le besoin d'extrait coagulant en fromagerie se fait sentir. Dans ce travail on décrit la qualité de l'extrait coagulant à base de pepsine obtenu à partir des caillettes des zébu (Bos indicus) adultes. On a macéré des caillettes séchées à différentes températures (30 à 70° C) dans une saumure de concentration variable en NaCl (5 à 25 g / 100 ml), de pH variable (pH 1,5 à 6,5) et pendant des temps variables (3 à 9 jours). Les activités coagulante et protéolytique diminuent avec les augmentations de la température de séchage des caillettes, de la concentration de la saumure en NaCl et de la durée de macération. Un séchage des caillettes aux environs de 40 à 50 °C, une saumure contenant 5 % de NaCl sans modification de pH et une macération pendant 3à 5 jours ont donné des résultats satisfaisants.
Contexte
	La pepsine est une enzyme couramment utilisée dans l'industrie agro-alimentaire pour attendrir la viande (IL SHIN CHOE YON JIN PARK et al., 1996 ; AISHIMA et al., 1996), modifier les propriétés fonctionnelles des protéines alimentaires (MYEONG HWA CHA et al., 1993), coaguler le lait (WEBBS et al., 1983).  On l'a obtenu à partir des tissus des poissons (TAVARES et al., 1993), de ceux des oiseaux (UYSAL et al., 1996) ainsi que de ceux de divers mammifères notamment le porc (WEBBS et al., 1983), le chameau (WANGOH et al., 1993), les bovins.  Plusieurs auteurs ont fait des extractions à partir des caillettes des vaches adultes (Bos taurus): ANDREN et al., 1981, FRIENDENTHAL et CHAUDHARI, 1970, VALLES et FURRET, 1981, ZALAZAR et REINHEIMER, 1980 ;d'autres ont préparé cet extrait à partir des caillettes de buffles adultes (Bubalus caffer), FAHMI et al., 1979.  Par contre, en dehors des travaux très anciens de PURCHASE, 1944, les travaux publiés sur les extraits de pepsine de zébu adulte (Bos indicus) sont très rares.  C'est pour connaître la qualité de l'extrait de pepsine que l'on peut obtenir en utilisant les techniques simples de macération que ce travail a été mené.  Des conditions différentes d'extraction (température, concentration saline, pH, durée) et de stabilité (solution saline) seront suivies.
Description/Mise en oeuvre
MATERIEL ET MÉTHODES

	Tous les produits chimiques utilisés sont purifiés pour les analyses.
	Les caillettes sont fraîchement prélevées des zébus adultes âgés de 3 à 7 ans.  Elles sont lavées, débarrassées des tissus adipeux puis séchées dans une étuve bien ventilée; elles sont ensuite découpées en petits morceaux avant d'être mises à macérer.  La macération se fait à la température ambiante par introduction de 40 g de tissus dans 200 ml de saumure contenant du C6H5CO2Na (Merck) à 0,1 % selon ZALAZAR et al., (1980) du H3BO3 (Riedel-de Haën) à 4 % et du NaCl (Riedel-de Haën) à différentes concentrations.
	Le liquide débarassé des tissus est additionné de 0,2 % d'une solution concentrée de KAl(SO4)2.12H2O (Prolabo) pour précipiter les mucilages.  Le pH tombe au voisinage de pH 4; celui-ci est ramené à 2 pendant quelques heures ensuite on le remonte à 5,5 par addition de Na2HPO4 (Riedel-de Haën) selon VALLES et al., (1977).  Toutes les expériences sont répétées 2 ou 3 fois.
	Le séchage des caillettes se fait dans une étuve bien ventilée entre 30 et 70 °C.  La concentration de la saumure en NaCl varie entre 5 et 25 %.  Le pH de la solution extractive modifiée par addition de HCl ou du NaOH dilué est compris entre pH 1,5 et 6,5 alors que la durée de macération varie entre 3 à 9 jours.
	Le substrat de Berridge est obtenu en dissolvant 12 g de lait en poudre (low heat, lot N° 4 INRA Poligny, France) dans 100 ml de CaCl2, 2H2O 0,01 M.
Les temps de coagulation sont déterminés à 30 °C selon la méthode de BERRIDGE (1952) et COLLIN et al., (1977) en mettant 0,5 ml de la solution enzymatique dans 10 ml de lait reconstitué.  L'activité enzymatique est exprimée en unité-présure (UP) et calculée selon la relation suivante:
UP = 10V / Tv-a
avec
		V volume de lait reconstitué en ml
		T temps de coagulation en seconde
		v volume de la solution enzymatique en ml
		a la constante qui permet d'obtenir la proportionnalité parfaite entre le temps de floculation et l'inverse de la concentration et qui selon le vendeur de la poudre est zéro pour la pepsine bovine.
	La densité est déterminée à 15 °C par pesée.  La matière sèche est obtenue par dessiccation à 105 °C selon le Recueil des Normes Françaises (1980).
	L'activité protéolytique est déterminée sur une solution de caséine (Fluka AG-9470 Buchs) à 2 % à pH 5,7 et à 30 °C emprésurée à 10 %.  Au bout de 3 h, la quantité d'azote non protéique est analysée dans le filtrat trichloracétique à la concentration finale de 12 % selon ROWLAND (1938) et GARNIER (1957).  Toutes les fractions azotées (azote non protéique, NPN et azote total, NT) ont été dosées par la méthode de Kjeldalh décrite par HORWITZ (1980) et en utilisant un catalyseur à base de sélénium.
	On obtient les taux de chymosine et de pepsine en soumettant 1 ml de la solution enzymatique à la chromatographie sur sepharose selon GREGORIO DI et al., (1979) (a) et en utilisant une colonne de 42 cm de haut et de 11 mm de diamètre.  La hauteur du gel est de 30 cm et le débit de 9,5 ml / h. Le collecteur des fractions est le Microcol TDC 80 de Gilson.  Des fractions de 5 ml ont été récoltées.  Le taux de chymosine est donné par la différence entre l'activité coagulante totale et l'activité coagulante retrouvée dans le premier pic de l'éluat selon GREGORIO DI et al., (1979) (b).  Les densités optiques sont mesurées au spectrophotomètre à 280 nm.
	L'analyse microbiologique est réalisée sur le tryptone glucose yeast agar pour le dénombrement des germes mésophiles aérobies, le trypticase sulfite néomycine gelose pour les germes sulfito-reducteurs, l'eau petonée exempte d'indole pour les germes indologènes selon GUIRAUD et al., 1980.

Résultats/Eléments chiffrés
Le volume de la solution récoltée augmente avec l'augmentation de la température de séchage des caillettes; entre 30 et 70 °C ce volume passe pratiquement du simple au double (65 à 118 ml).  On retrouve aussi cette augmentation (17 %) quand la concentration en NaCl passe de 5 à 25 %; il en est de même avec le pH.  La durée de macération a plutôt un effet défavorable sur ce volume.  La densité diminue avec l'augmentation de la température de séchage des caillettes et avec l'accroissement du pH de la solution extractive ; elle augmente évidemment avec la concentration en NaCl et reste pratiquement stable quand la durée de macération se prolonge.  Les variations de l'extrait sec total et de la densité se font dans le même sens.  La quantité d'azote totale des extraits diminue avec l'augmentation de la température de séchage des caillettes.  Le pourcentage des matières azotées dans la totalité de la matière sèche diminue à la fois avec l'augmentation de la concentration en NaCl et la durée de macération toutefois il admet un maximum pour une température de séchage voisine de 50 °C et pour un pH voisin de pH 5.  Les augmentations de la température de séchage des caillette, de la concentration de la saumure en NaCl n'améliorent pas l'activité coagulante de la solution.  L'effet du pH sur la teneur totale de l'azote de l'extrait se caractérise par un optimum autour de pH 4 au-delà  duquel très peu d'azote passe en solution. En tenant compte du volume total de l'extrait, l'activité coagulante diminue légèrement avec l'augmentation de la température de séchage des caillettes et avec la concentration de la saumure en NaCl; elle diminue beaucoup avec la durée de macération.  On note par contre un effet très favorable du pH sur l'activité coagulante totale.  En exprimant l'activité coagulante par rapport à la matière sèche, on s'aperçoit qu'elle n'est améliorée ni par l'augmentation de la température de séchage des caillettes, ni par la concentration en NaCl.
L'activité coagulante par unité d'azote atteint son maximum pour une température de séchage des caillettes voisine de 50 °C, pour un pH voisin de 6,5 et pour une durée de macération voisin de 4 jours.  Cette activité diminue avec l'augmentation de la concentration de la solution en NaCl.
	L'activité protéolytique de l'extrait diminue avec l'augmentation de la concentration de la solution en NaCl, elle augmente aussi avec la durée de l'extraction et elle admet un maximum pour une température de séchage voisine de 45 °C et un pH voisin de pH 4 (figure 2b).  Après huit mois de conservation au réfrigérateur, la perte d'activité coagulante est environ 40 fois plus grande dans l'extrait de pepsine obtenu avec de la saumure à 20 % de NaCl que celle à 5 %.  L'extrait de pepsine se conserve donc mieux selon qu'il contient moins de NaCl..
	Le dénombrement des germes dans l'extrait de pepsine a indiqué pour deux essais une moyenne par ml de 0 germe aérobie mésophile, 0 coliforme, 0,5 germe indologène, 0 aérobie sporulé, 5 germes anaérobies sulfito-reducteurs.

Enseignements
Les paramètres étudiés (température de séchage des caillettes, concentration de la saumure en NaCl, pH de cette saumure, durée de macération) ont tous des effets sur les caractéristiques de l'extrait de pepsine notamment sur son volume, sa densité et ses teneurs en matière sèche et azote total.  Des faibles températures de séchage des caillettes (30 °C) donnent des caillettes mal séchées qui se macèrent mal alors que les températures de séchage très élevées 60 à 70 °C même si elles conduisent à des plus importants volumes de solution, donnent finalement des extraits de pepsine de faible activité coagulante totale et ayant de faibles UP par mg d'azote probablement à cause de la dénaturation par cuisson des protéines et de leur insolubilisation.

Reproductibilité / Changement d'échelle
L'extrait enzymatique utilisé dans la coagulation du lait ne doit pas contenir des germes pathogènes.
Avec les utilisations de plus en plus massives des extraits coagulants du lait, il serait souhaitable que le Cameroun se dote d'une réglementation en la matière

Auteur : David Gabriel LIBOUGA, Joseph AKOA 
Saisie le : 30/06/2004